SPRINTseq Sequencing Run

SPRINTseq 上机测序流程（详细版 240718cty）

  1. 拿出测序的三个试剂（ICM，USM和CRM）以及NEM化冻，三个试剂常温下大概5min化冻，NEM大概30min化冻。建议ICM，USM和CRM放在冰浴上化冻，NEM在常温化冻

  2. D盘FISH

    Images下**建新的文件夹**，文件夹格式需以年月日开头。将对应的测序文件（10bp/12bp等）转移到该文件夹下。检查D盘剩余空间，如果不够则在NAS将文件从raw_images转移到raw_images_archive，同步盘会删除160上D盘对应的文件。至少留出100G以上的剩余量

  3. 装flow cell，上机，注意装片时两个出入口有**胶垫**，注意将flow

    cell对进凹槽内但不要过于用力，螺丝也不要过于用力拧紧。将DAPI和测序引物拿出，引物化冻后vortex并确认液体全部在ep管下方

  4. 打开相机，打开自动对焦，记得WDI_initiate让Labview连接WDI。在Live_02下确定视野边界，**记得文件夹路径一定要修改**否则新生成的范围文件会覆盖别的文件夹的范围文件。检查自动对焦是否正常工作：打开live后，在样本附近不太远时WDI会返回511，处于工作范围内时WDI会返回跳动的值，WDI

    AF

    once使其处于它认为的起始位置，若此时z离0太远（比如绝对值大于5um），记得Zero

    Z

  5. automator运行测序文件，简单scan一遍所有视野，待scan 结束后停下主程序

  6. 用matlab拼接测序文件，将范围文件复制一份'unfiltered'版本。然后打开范围文件，参考拼接的图像，删除范围文件中空白视野的行。记得保存，记得检查范围文件是否多了一些字符。将cyc_0的两个文件前加下划线

  7. 将ICM，USM，CRM和NEM包上parafilm并插管路，注意**NEM一定要晃动检查完全没有沉淀，ICM，CRM，USM在插管路前也要轻柔的上下摇晃液体**。NEM在常温。在scripts_01文件夹中运行上样文件，记得检查相应管路是否能看到液体移动。随后debubble。

(如果注射泵没有移动，切记在manual

panel中将管路切换到2后，运行initialize

pump文件)，测序引物和DAPI也插管路

  1. 检查**USB，CWM，10%SDS，乙醇常温试剂**是否充足，检查**废液缸**内是否装满液体。

  2. 一切准备就绪后继续运行automator的测序文件，注意**从第7行**（之前停止的行数）开始运行，注意看测序引物是否上样，且上样后flow

    cell内是否充满液体

  3. 等待20分钟左右检查第一轮信号（其中有WAIT

    10000的停止），如果正常，继续运行，此后再无WAIT

    10000，需偶尔检查拍照，流体等是否正常

  4. 测序结束后，清洗管路，最好手动逐个清洗，测序引物（10）5次DNA off

    5次MilliQ

    2次空气，剩余的试剂均至少5次MilliQ2次空气，随后**上样PBS**（5）至少一管装满管路，关闭WDI，关闭相机

注意！

***

注意测序轮数和试剂体积的关系，目前的测序刚好够10轮，如果测12轮需在测序开始2-3轮后添加试剂补足体积

*** 注意测序开始后不要触碰测序仪带来register的误差

***

如更改测序文件的内容，则需重命名该文件对应修改内容，以防下次误用

管路对应：

8-DAPI

9-NEM （常温）

10-seqPrimer测序引物

12-ICM（紫色/淡紫蓝色）

13-USM

14-CRM