滚环扩增 (RCA)

滚环扩增 (RCA) 是 PRISM 和 SPRINTseq 背后的信号放大引擎。它将环化的 DNA 探针扩增为长的单链 DNA 串联体（DNA 纳米球或 "Rolony"）。

机制

1. 环化: 挂锁探针与靶标杂交并连接成环。
2. 聚合: Phi29 DNA 聚合酶（一种高持续合成能力的链置换聚合酶）连续绕环复制。
3. 结果: 包含数千个探针序列串联重复的长链。

组织实验流程

试剂

• Phi29 DNA 聚合酶 (例如 NEB 或类似产品)
• dNTPs
• BSA
• 甘油

步骤

1. 洗涤: 用 PBS-T (0.05% Tween-20) 洗涤载玻片 3 次。
2. 预孵育: 加入 RCA 预混液（仅缓冲液）5 分钟。
3. 扩增:
   • 加入含 Phi29 的反应混合液。
   • 密封反应室（可选，防止蒸发）。
   • 30°C 孵育。
   • 时长: 通常 2 小时 到 过夜，取决于所需的 Rolony 大小。
4. 终止: 用 PBS-T 洗涤以去除聚合酶。

故障排除

问题	可能原因	解决方案
无信号	连接失败	检查连接酶活性和探针设计。
高背景	非特异性结合	增加洗涤强度或添加封闭剂 (BSA/tRNA)。
信号模糊	过度扩增	减少 RCA 时间。