PRISM 湿实验流程

安全第一

处理试剂（特别是 PFA 和甲酰胺）时，请务必穿戴适当的个人防护装备 (PPE)。

1. 材料与试剂

• 具体货号请参考 试剂清单 (BOM)。
• 关键缓冲液:
  • PBS (1x)
  • Wash Buffer A (基于甲酰胺)
  • RCA 反应混合液

2. 样本制备

2.1 组织切片

• 厚度: 推荐 10 µm。
• 基质: 多聚赖氨酸包被的盖玻片或功能化载玻片。

2.2 固定

1. 用 PBS 清洗样本 5 分钟。
2. 在 4% PFA 中室温固定 15 分钟。
3. 用 PBS 清洗 3 次。

3. 逆转录 (RT)

• 注意：详细 RT 步骤待从 SOP 添加。

4. 挂锁探针杂交

1. 制备杂交混合液:
   • 200 nM 挂锁探针 (Padlock Probes)
   • 1 U/µl RNase 抑制剂
   • 1x Ampligase 缓冲液
2. 37°C 孵育 30 分钟，然后 45°C 孵育 45 分钟。

5. 连接

• 注意：详细连接步骤待添加。

6. 滚环扩增 (RCA)

有关此步骤的详细机制和优化，请参阅 通用 RCA 模块。

1. 加入 RCA 混合液 (Phi29 DNA 聚合酶, dNTPs)。
2. 30°C 孵育 >2 小时 (若需更大 Rolony 可过夜)。

7. 成像

前往 成像指南。